Idei266 - Metode aplicate

Înregistrări electrofiziologice in vivo. Pentru studierea fenomenelor electrice folosim un model de epilepsie in vivo cronic. Modelele experimentale clasice chimice sau electrice de post-status epileptic au unele dezavantajele: mortalitatea mare a animalelor de experienţă datorită statusului epileptic, controversele legate de relevanţa umană al unei epileptogeneze pe un creier alterat sever, frecvenţa foarte mare a crizelor (câteva/zi) ceea ce denotă o epilepsie extrem de severă, rareori întâlnită la oameni şi care produce un discomfort sever animalelor. Din acest motiv folosim un model de epilepsie in vivo ce presupune stimularea electrică repetată ("kindling") dar cu o frecvenţă şi intervale ce nu induc status epileptic sever. Modelul reproduce fenomenologia clinică a crizelor complexe parţiale şi crizele generalizate secundar reproducând aproape toate aspectele cunoscute ale epileptogenezei umane. Modelul este superior în ceea ce priveşte înţelegerea evolutivă a epileptogenezei având în acelaşi timp şi avantajul că produce doar leziune limitată cu debut focal al crizelor, caracteristică epilepsiei umane. Iniţial crizele epileptice apar doar în cazul stimulării propriu zise. Ulterior apare creşterea duratei crizelor facilitate şi mai târziu debutează şi crizele epileptice spontane mimându-se în acest mod cele mai tipice aspecte evolutive ale epilepsiei umane.
Metode de imunohistochimie. Moartea celulară va fi studiată prin metoda impregnării cu argint descrisă de Gallyas. Folosind tehnici standard de preparare a secţiunilor pentru imunohistochimie se încearcă identificarea unor populaţii neuronale prin utilizarea unor anticorpi specifici pentru două proteine care leagă calciul, calbindina şi parvalbumina (PV), pentru somatostatină (SOM) şi pentru subunitatea alfa1 al receptorilor GABA-A. Aceşti markeri au fost aleşi în aşa fel încât pe lângă identificarea pozitivă a interneuronilor să putem diferenţia cele mai importante subpopulaţii de interneuroni (celulele cu coşuleţe, celulele bistratificate, celulele axo-axonice).
RT-QPCR. Din unele secţiuni preparate pentru imunohistochimie o parte a structurilor limbice este disecată şi folosită separat pentru extragerea ARN şi ulterior pentru RT-QPCR.
Modelarea computerizată. Rezultatele funcţionale obţinute prin înregistrările electrofiziologice şi cele structurale obţinute prin imunohistochimie şi PCR sunt înglobate în modele neuronale pe computer în vederea îmbunătăţirii metodelor de înregistrare, pentru reducerea numărului de animale de experiment necesare precum şi pentru o înţelegere mai bună a mecanismelor epileptogenezei. Pentru simulare se foloseşte programul NEURON, dezvoltat de M. Hines şi T. Carnavale, care este un program flexibil creat pentru a implementa modele realistice din punct de vedere biologic a neuronilor care comunică pe cale chimică sau electrică şi a reţelelor de neuroni. În cadrul acestui proiect modelăm interneuronii recent caracterizaţi atât din punct de vedere morfologic cât şi electrofiziologic (celulele cu coşuleţe, bistratificate, OLM , axo-axonale). Se urmăreşte realizarea conexiunilor interneuronale cât mai apropiat de realitatea anatomică. Apoi se vor determina posibilităţile de simplificare a acestor modele, fără a schimba semnificativ comportamentul electric al celulelor. Această simplificare permite timp de simulare mult mai scăzut şi în consecinţă construirea ulterioară a unei reţele extinse, modelând mai fidel structura şi activitatea hipocampului. În această fază vom construi reţele neuronale care iau în considerare rezultatele morfologice/moleculare obţinute în faza anterioară. Se va încerca determina cantitativă şi calitativă a elementelor necesare ca modelul să reproducă oscilaţiile de frecvenţă înaltă înregistrate in vivo.